F1：QPCR 設(shè)計引物應(yīng)該注意什么？
A1：（1）擴增產(chǎn)物推薦長度 80-200bp，越短擴增效率越高，為了和引物二聚體做明顯區(qū)分，長度要大于80bp，太長會導(dǎo)致擴增效率下降；
（2）3’端盡量避免高GC或高AT含量區(qū)域；
（3）最后一個堿基最好為G或者C，避免使用T；
（4）正反向引物的Tm值最好相差不要超過1℃；
（5）GC含量最好在40-60%；
（6）如果后續(xù)用探針法，注意探針Tm值高于引物Tm值8-10℃。
F2：cDNA模板需要稀釋嗎？應(yīng)該稀釋多少倍進行定量？
A2：沒有具體的稀釋參考倍數(shù)，一般cDNA每稀釋10倍CT值變大3.3，可以根據(jù)這個規(guī)律進行合適的稀釋?？梢允褂胏DNA原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液作為模板進行定量實驗，根據(jù)規(guī)律選擇CT值落在18-28，或者15-33范圍內(nèi)的稀釋倍數(shù)。也可以參考換試劑之前的稀釋倍數(shù)。
注：當使用 cDNA 原液進行檢測的時候，使用量不能超過qPCR 反應(yīng)體系的 1/10，因為 cDNA 中包含很多抑制 qPCR 的組分，cDNA 體積大時風(fēng)險很高。
F3：擴增曲線形狀異常
A3：(1) 擴增曲線不光滑：信號太弱，經(jīng)系統(tǒng)矯正后產(chǎn)生。建議提高模板濃度重復(fù)實驗。
(2) 擴增曲線斷裂或下滑：一般由于模板濃度較高，基線的終點值大于CT值。建議減小基線終點（CT值-4），重新分析數(shù)據(jù)。
(3) 個別擴增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。建議反應(yīng)前要仔細檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。
(4) 擴增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)：ROX添加不當。需校正參比染料。
F4:標準曲線擴增小于90%或者大于120%，線性關(guān)系不佳
A4：（1）加樣誤差。加大模板稀釋倍數(shù)，提高加樣體積，使用不同稀釋梯度的濃度更準確；
（2）標準品降解，重新制備標準品，重復(fù)實驗；
（3）模板濃度過高，存在抑制反應(yīng)，增加模板稀釋倍數(shù)；
（4）引物擴增特異性不好，重新設(shè)計引物重復(fù)實驗。
F5：反應(yīng)結(jié)束無擴增曲線出現(xiàn)
A5：⑴ 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為40，但需要注意的是過多的循環(huán)會增加過多的背景信號，降低數(shù)據(jù)可信度。
⑵ 確認程序中是否設(shè)置了信號采集步驟：兩步法擴增程序一般將信號采集設(shè)置在退火延伸階段；三步法擴增程序應(yīng)當將信號采集設(shè)置在72℃ 延伸階段。
⑶ 引物不合適：重新設(shè)計引物；確認引物是否降解：長時間未用的引物應(yīng)先通過PAGE電泳檢測完整性，以排除其降解的可能。
⑷ 模板濃度太低：減少稀釋度重復(fù)實驗，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。
⑸ 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實驗。
F6:CT值的有效性判斷
A6: (1) 融解曲線單峰（染料法）
(2) 擴增曲線指數(shù)擴增區(qū)域，復(fù)孔間CT值STD<0.2
(3) 閾值設(shè)置合理
(4) NTC確認無氣溶膠污染或可以忽略
(5) NRT確認無基因組殘留污染或可以忽略
(6) 擴增效率符合近似計算標準，標準曲線相關(guān)系數(shù)R2大于0.98，擴增效率e介于95-105%或者90-120%之間。
F7：CT值出現(xiàn)太晚。
A7：(1) 擴增效率極低。優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設(shè)計合成引物。
(2) 模板濃度太低。減少稀釋度重復(fù)實驗，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。
(3) 模板降解。重新制備模板，重復(fù)實驗。
(4) PCR產(chǎn)物太長。推薦PCR產(chǎn)物長度為80 bp-150 bp。
(5) 體系中存在PCR抑制劑。一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實驗。
F8:NTC（陰性對照）出現(xiàn)CT值，目的基因的CT值還能使用嗎？
A8：NTC出現(xiàn)擴增一般會有兩種情況：
⑴ NTC與目的基因融解曲線峰形不重疊。一般NTC的Tm值較目的基因Tm值小。這種情況下，NTC的CT值是由引物二聚體造成的，并不影響目的基因CT值的采集。
⑵ NTC與目的基因融解曲線峰形重疊。NTC的Tm值等于目的基因的Tm值。
這種情況下，說明體系已被氣溶膠污染了。體系被污染，目的基因的CT值還能正常使用嗎？
需要計算目的基因的CT值與NTC 的CT值的差值（△CT）差值來判定。若△CT≥5/3，說明氣溶膠帶來的污染對體系影響非常小，可以忽略不計。若△CT＜5/3，說明污染比較嚴重，目的基因的CT值是不能使用的。
F9：NRT出現(xiàn)明顯擴增
A9：NRT出現(xiàn)明顯擴增說明有基因組污染可通過實驗組和NRT的CT之差異來判斷實驗數(shù)據(jù)是否可用。
當實驗組CT值和NRT CT值差值大于5，說明郵gDNA但值得誤差小于5%，則可以忽略；若實驗組CT值和NRT CT值差值大于3或者幾乎一致，則實驗組擴增產(chǎn)物的模板很大部分來源于gDNA，這樣的實驗組就失去定量意義，建議使用去基因組的RNA提取試劑盒進行RNA提取，或者反轉(zhuǎn)錄時加入去基因組步驟。
F10：融解曲線出現(xiàn)多峰
A10：（1）引物設(shè)計不優(yōu)：根據(jù)設(shè)計原則設(shè)計合成新的引物;
（2）引物濃度太高：適當降低引物濃度;
（3）cDNA模板帶有基因組污染：重新制備cDNA模板;
（4）CT值≥30易出現(xiàn)非特異擴增；
（5）提高退火溫度(不超過63℃）
（6）增加模板濃度：當目的基因表達量極低時，染料法qPCR容易形成引物二聚體產(chǎn)物影響實驗結(jié)果，提高模板濃度。
F11:定量儀器報錯出現(xiàn)BadRox？
A11：遇到BadRox 的問題，可能出現(xiàn)的原因有：
⑴ 儀器問題：儀器需要校準，ABI 儀器需要每年校準一次，長時間不校準，會出現(xiàn)熒光信號采集異常；儀器老化，同樣需要請儀器工程師進行校準或更換零部件。
⑵ 客戶體系過低，如10μl 擴增體系，因添加體系較低而導(dǎo)致ROX總濃度偏低，易出現(xiàn)BadRox現(xiàn)象。
⑶ 試劑本身添加的ROX濃度較低，低于儀器檢測的閾值
F12：實驗重復(fù)性差
A12：（1）加樣體積失準，使用準確度較好的移液槍，擴大反應(yīng)體系，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中；
（2）定量PCR儀不同位置溫度控制不一致。定期校準儀器。
（3）模板濃度太低。模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
（4）做4-6個復(fù)孔，刪除其中重復(fù)性不好的孔，將剩余的進行后續(xù)計算。
F13：高GC含量的模板，建議用什么產(chǎn)品進行定量？
A13：建議用Q111進行定量
F14：如果內(nèi)參CT值很低，目的基因CT值很高，該如何稀釋樣品？
A:14：可以在定量內(nèi)參的時候?qū)⒛０逑♂專磕康幕驎r模板不稀釋，結(jié)果仍舊采用 2-ΔΔCT進行計算，CT值減兩次，稀釋倍數(shù)會被相應(yīng)減掉，但要保證不同樣品在檢測同一基因時稀釋倍數(shù)要一致。
F15：模板的稀釋液選擇。
A15：稀釋模板可以使用購買的Nuclease-free water、DEPC水或者實驗室自備的ddH2O等。TE里有EDTA會抑制酶的活性，不可作為稀釋液。
F16:如何消除體系中的氣溶膠污染?
A16：⑴ 更換新的Mix、引物、模板。
⑵ 反應(yīng)體系盡可能在超凈臺內(nèi)操作，減少氣溶膠污染。超凈臺內(nèi)臺面需要定期使用稀釋后的84消毒液進行擦拭，使用酒精棉球擦拭移液器，并使用紫外燈照射，以消除長期加樣造成的核酸污染。
⑶ 嚴禁在加樣房間打開qPCR產(chǎn)物的管蓋。
⑷ 使用Vazyme #R504 RNA酶和核酸清除劑。
F17：如何確定基因表達量高低。
A17：如果基因擴增CT值超過30，使用PCR產(chǎn)物通過梯度稀釋創(chuàng)建標準曲線，判斷該引物擴增效率，若擴增效率滿足90-120%，則可以判斷該基因擴增CT值偏大是由于基因表達量低所致。
F18：復(fù)孔間重復(fù)性差？
A18：復(fù)孔間重復(fù)性差一般會有兩種情況：
情況1：CT值很大，如CT≥30，重復(fù)性差屬于正常現(xiàn)象。該現(xiàn)象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情況下，模板與引物的碰撞存在隨機性，直接導(dǎo)致復(fù)孔間的CT值差異較大。
解決方法：如果融解曲線沒有雜峰，無模板陰性對照同目的基因的△CT值為5以上，那CT值為準確的，可多設(shè)置幾個復(fù)孔，選擇重復(fù)性好的CT值參與計算。
情況2：CT值正常，如CT＜30，重復(fù)性較差。一般同操作有關(guān)。
解決辦法：從以下幾個方面進行問題的排查：
①加樣準確度；②移液器吸取液體的準確度；③定期校準qPCR儀。
- 加樣準確度
⑴避免小體積加樣，減少加樣誤差?？梢詫⒁铩YBR Green Mix、ddH2O配置成混合體系，并且增加模板的稀釋梯度，大體積加樣。如：原液cDNA添加1μl，可以更改為原液cDNA稀釋5倍，添加5μl，使用ddH2O補齊體系至20μl即可。
⑵SYBR Green Mix、配置的混合體系需要混合均勻。從-20℃冰箱拿出的試劑需要完全融化并上下顛倒徹底混勻；配置體系時，將混在一起的Mix用移液器吹打混勻。
- 移液器吸取液體的準確度
⑴移液器量程定期校準，校準周期為1年。
⑵購買與移液器配套的槍頭，若槍頭與移液器不匹配，在吸取液體時易出現(xiàn)漏氣的現(xiàn)象，導(dǎo)致吸取量程不準確。在吸取相同量程的液體體積時，注意觀察每次吸取液體在槍頭內(nèi)的液面高度是否一致。
- 定期校準qPCR儀：一般qPCR儀校準周期為一年。
F19：相對定量為什么要做標準曲線？
A19：相對定量分析中采用2-ΔΔCT公式進行計算比較不同樣品中基因的表達量時，前提是該體系的擴增效率e是盡可能接100%的。相對定量中做標準曲線的目的就是為了判斷該擴增體系中的擴增效率e是否是接近100%，能否用2-ΔΔCT公式進行計算；如果擴增效率e與100%相差很大，在比較基因表達差異時是需要帶入實際的擴增效率進行計算的。
F20：怎么做絕對定量？
A20：首先需要有一個已知拷貝數(shù)濃度的樣品作為標準品，將其稀釋至少5個梯度后和待測樣品同時上機進行定量檢測，以標準品拷貝數(shù)的Log值為橫坐標，以標準品的CT值為縱坐標繪制標準曲線方程，將檢測獲得的待測樣品的CT值帶入標準曲線方程中就能求得待測樣品的拷貝數(shù)濃度。
